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革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的種重要的鑒別方法，而實驗成功率低，常常出現(xiàn)假陽性或假陰性的結果，對初學者來說難度較大。因此，我們選取大腸桿菌作為G代表，枯草芽孢桿菌作為G代表，分析影響革蘭氏染色結果的各種因素，提高染色結果的準確性。

1.實驗材料

1.1菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。

1.2試劑：草酸銨結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅染液。

2.實驗方法和結果

2.1菌齡對染色結果的影響

革蘭氏染色要求菌種被染色時處于活躍生長期。大腸桿菌的活躍生長期為24h左右，枯草芽孢桿菌活躍生長期為在14～16h，故對不同培養(yǎng)時間的菌種分別選擇10個時間段進行革蘭氏染色觀察。實驗結果見表1。

由表1可見，培養(yǎng)時間對染色結果影響較大，不同菌種對培養(yǎng)時間有不同要求。處于活躍生長期的菌體細胞結構為典型，能正確反映染色的結果。其中，大腸桿菌培養(yǎng)24h左右為宜，而枯草芽孢桿菌培養(yǎng)15h左右為宜。

2.2涂片厚度對染色結果的影響

用直徑3mm的接種環(huán)分別挑起培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌滿環(huán)、半環(huán)、更少量涂片，從中央向外圍涂開，使細菌在小滴生理鹽水中涂成直徑約1cm的菌膜，堆積密度由濃厚到均勻分散，作革蘭氏染色觀察。結果顯示：涂片濃厚時，大腸桿菌因密集脫色不完全而呈陽性反應，枯草芽孢雖呈陽性但是染色均勻度欠佳；涂片太薄，菌體過于稀少，觀察時尋找視野較麻煩。因此，只有在菌膜厚度均勻分散、肉眼能見無菌生理鹽水稍顯渾濁時，才能得到較佳的染色結果。

2.3媒染時間對染色結果的影響

將培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌革蘭氏染色，碘液作為媒染劑，覆蓋時間分別為30s、60s、90s、120s。實驗結果見表2。

由表2可見，媒染時間過短，不利于結晶紫—碘的復合物與細胞之間的結合，可能造成枯草芽孢桿菌（G）呈假陰性的結果，但對大腸桿菌（G）無影響；反之，媒染時間過長，結合過于牢固，容易造成大腸桿菌（G）假陽性的結果，但對枯草芽孢桿菌（G）影響非常小。因此，媒染時間應控制在60s為宜。

2.4乙醇脫色對染色結果的影響

脫色是影響革蘭氏染色的關鍵步驟，脫色時間直接關系到染色結果的準確性。我們選擇10s至60s的脫色范圍，分6個時間分別進行實驗。實驗結果見表3。

由表3可見，脫色程度不夠，大腸桿菌（G）可被染成假陽性，對枯草芽孢桿菌（G）影響較??；脫色過度，枯草芽孢桿菌（G）容易成假陰性，對大腸桿菌（G）影響較小。這是由于酒精脫色時間長使得細胞壁中脂類物質易被溶解，細胞通透性增大，導致結晶紫—碘復合物易被抽提出來；反之，脫色時間短，復合物就不易從細胞壁中逸出，而兩種菌種化學組成有差別，染色受影響程度不樣。因此，革蘭氏染色時，定要嚴格控制酒精脫色時間，般以25～30s為宜。

3.結果分析

通過以上實驗和分析，我們認為菌齡、細菌密集程度、媒染時間、酒精脫色程度這幾個因素都會影響革蘭氏染色結果的正確性，同時還受干燥、固定等操作的影響。因此在進行革蘭氏染色液實驗教學和科研工作中，除操作正確適當外，更重要的是選擇適合的菌齡和準確把握脫色時間，這樣才能保證染色結果的正確性。